PCR 實用技巧
增加PCR的特異性：
1. primers design
這是zui重要的一步。理想的，只同目的序列兩側(cè)的單一序列而非其他序列退火的引物要符合下面的 一些條件
a. 足夠長,18-24bp,以保證特異性.當(dāng)然不是說越長越好,太長的引物同樣會降低特異性,并且降低產(chǎn)量
b. GC% 40%~~~~60%
c. 5'端和中間序列要多GC,以增加穩(wěn)定性
d. 避免3'端GC rich, zui后3個BASE不要有GC,或者zui后5個有3個不要是GC
e. 避免3'端的互補, 否則容易造成DIMER
f. 避免3'端的錯配
g. 避免內(nèi)部形成二級結(jié)構(gòu)
h. 附加序列（RT site, Promoter sequence）加到5'端, 在算Tm值時不算,但在檢測互補和二級結(jié)構(gòu)是要加上它們
i. 使用兼并引物時, 要參考密碼子使用表,注意生物的偏好性,不要在3'端使用兼并引物,并使用 較高的引物濃度（1uM-3uM）
j. 學(xué)會使用一種design software. PP5,Oligo6,DNAstar, Vector NTI, Online desgin et al.
* 引物的另一個重要參數(shù)是熔解溫度（Tm）。這是當(dāng)50％的引物和互補序列表現(xiàn)為雙鏈DNA分子時的溫度.Tm對于設(shè)定PCR退火溫度是必需的。在理想狀態(tài)下，退火溫度足夠低，以保證引物同目的序列有效退火， 同時還要足夠高，以減少非特異性結(jié)合。合理的退火溫度從55℃到70℃。退火溫度一般設(shè)定比引物的 Tm低5℃。
設(shè)定Tm有幾種公式。有的是來源于高鹽溶液中的雜交，適用于小于18堿基的引物。
有的是根據(jù)GC含量估算Tm。確定引物Tmzui可信的方法是近鄰分析法。這種方法從序列一級結(jié)構(gòu)和 相鄰堿基的特性預(yù)測引物的雜交穩(wěn)定性。大部分計算機程序使用近鄰分析法。
根據(jù)所使用的公式及引物序列的不同，Tm會差異很大。因為大部分公式提供一個估算的Tm值，所有退火溫度只是一個起始點?？梢酝ㄟ^分析幾個逐步提高退火溫度的反應(yīng)以提高特異性。開始低于估算的Tm5℃，以2℃為增量，逐步提高退火溫度。較高的退火溫度會減少引物二聚體和非特異性產(chǎn)物的形成。
為獲得*結(jié)果，兩個引物應(yīng)具有近似的Tm值。引物對的Tm差異如果超過5℃，就會引物在循環(huán)中使用較低的退火溫度而表現(xiàn)出明顯的錯誤起始。如果兩個引物Tm不同，將退火溫度設(shè)定為比zui低的Tm低5℃
或者為了提高特異性，可以在根據(jù)較高Tm設(shè)計的退火溫度先進(jìn)行5個循環(huán)，然后在根據(jù)較低Tm設(shè)計的退火溫度進(jìn)行剩余的循環(huán)。這使得在較為嚴(yán)緊的條件下可以獲得目的模板的部分拷貝。2. stability of primers
定制引物的標(biāo)準(zhǔn)純度對于大多數(shù)PCR應(yīng)用是足夠的。
引物產(chǎn)量受合成化學(xué)的效率及純化方法的影響。定制引物以干粉形式運輸。在TE重溶引物，使其zui終濃度為100μM。TE比去離子水好，因為水的pH經(jīng)常偏酸，會引起寡核苷的水解。 引物的穩(wěn)定性依賴于儲存條件。應(yīng)將干粉和溶解的引物儲存在-20℃。以大于10μM濃度溶于TE的引物在 -20℃可以穩(wěn)定保存6個月，但在室溫（15℃到30℃）僅能保存不到1周。干粉引物可以在-20℃保存至少1年，在室溫（15℃到30℃）zui多可以保存2個月。
3. optimize reactants concentration
a. magnesiom ions
Mg離子的作用主要是 dNTP-Mg 與核酸骨架相互作用 并能影響Polymerase的活性，一般的情況下 Mg的濃度在0.5-5mM之間調(diào)整，同樣要記住的是在調(diào)整了dNTPs的濃度后要相應(yīng)的調(diào)整Mg離子的濃度，對實時定量PCR，使用3到5mM帶有熒光探針的鎂離子溶液
b. 其他的離子
NH4+ K+都會影響PCR，增加K+的濃度后, 會因為中和了核酸骨架上磷酸基團(tuán)的負(fù)電荷而影響退火的溫度,從而降低了PCR的 嚴(yán)謹(jǐn)性（stringency），NH4+也有相同的作用.TAQ酶就提供了兩種BUFFER, 一種是加Mg的一種是已經(jīng)混合了（NH4）2SO4的，當(dāng)然, 過高的陽離子濃度（KCL>0.2M）時, DNA在94度根本不會發(fā)生變性, 當(dāng)然也就無從談起PCR了.
c. polymerase
不同公司的酶效有所不同,需要operator自己掌握適合的酶的濃度，一些高保真沒的效率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于Taq polymerase,所以可能需要的酶的量也要大一些. 另外, 一般的 情況下, 變性的溫度可以使用90~92度, 變性的時間也可以縮短,從而保證polymerase的活性
d. template
50ul PCR SYSTEM
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human gDNA 0.1ug-1ug
E.Coli 10ng-100ng
LamadaDNA 0.5ng-5ng
Plasmid DNA 0.1ng-10ng
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4. termperature
a. denaturation
常規(guī)是94度5分鐘, GC Rich的摸板是95度5分鐘
除了GC Rich外, 常規(guī)的APPLICATIONS可以將這部分時間縮短到1到2分鐘, 或者在CYCLE 1時給予較長的時間,而取消開始的denaturation
b. annealing
重點到了：一般情況下, 是從55度開始.根據(jù)情況配合以Mg離子濃度進(jìn)行調(diào)整. 有條件的可以做gradient pcr. 退火的時間在30-60S, 時間短一些可以得到更好的效果. 因為, polymerase 在 annealing temp.時也會有一些活性. 所以在A.T.的時間過長, 會極大的增加非特異性擴增的風(fēng)險，另外,在對于一些困難戶, 比如從gDNA里擴增大片段, 還可使用two step PCR.
5. touchdown PCR
原理很簡單,但的確是一個很有用的方法。舉個例子，ANNEALING TEMP. 55度
94 5min
94 30s 60 30s 72 1min 2cycles
94 30s 59 30s72 1min 2cycles
94 30s 58 30s 72 1min 2cycles
94 30s 51 30s 72 1min 2cycles
94 30s 50 30s 72 1min 20cycles
72 5min
6. hot start PCR
熱啟動PCR是除了好的引物設(shè)計之外，提高PCR特異性zui重要的方法之一。盡管Taq DNA聚合酶的*延伸溫度在72℃，聚合酶在室溫仍然有活性。因此，在進(jìn)行PCR反應(yīng)配制過程中，以及在熱循環(huán)剛開始，保溫溫度低于退火溫度時會產(chǎn)生非特異性的產(chǎn)物。這些非特異性產(chǎn)物一旦形成，就會被有效擴增。在用于引物設(shè)計的位點因為遺傳元件的定位而受*，如site-directed突變、表達(dá)克隆或用于DNA工程的遺傳元件的構(gòu)建和操作，熱啟動PCR尤為有效。
限制Taq DNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反應(yīng)液，并將其置于預(yù)熱的PCR儀。這種方法 簡單便宜，但并不能完成抑制酶的活性，因此并不能*消除非特異性產(chǎn)物的擴增。
熱啟動通過抑制一種基本成分延遲DNA合成，直到PCR儀達(dá)到變性溫度。包括延緩加入Taq DNA聚合 酶，在反應(yīng)體系達(dá)到90度時，PAUSE，將溫度保持在70度以上，手工加入polymerase，但這個方法 過于煩瑣， 尤其是對高通量應(yīng)用，并容易造成污染。其他的熱啟動方法使用蠟防護(hù)層將一種基本 成分，入鎂離子或酶，包裹起來，或者將反應(yīng)成分，如模板和緩沖液，物理地隔離開。在熱循環(huán)時， 因蠟熔化而把各種成分釋放出來并混合在一起。有很多公司提供這樣的酶。
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ampliwax PCR Gems （Perkin Elmer）
Taq Bead Hot Start Polymerase （Promega）
Magnesium wax beads （Stratagene）.
=========================象手動熱啟動方法一樣，蠟防護(hù)層法比較煩瑣，易于污染，不適用于于高通量應(yīng)用。
還有一種方法是使用inactive DNA Polymerase. polymerase被抗體抑制失活，當(dāng)變性溫度超過70度時，抗體也變性了，這樣polymerase又被激活了。
7. Booster PCR
我們知道1ug human genomic DNA 大約在3X10 5冪個模板分子,這樣的模板分子數(shù)目可以是引物與模板很好的結(jié)合. 當(dāng)模板的濃度過低,比如低于100個分子時, 引物和模板之間就很難發(fā)生反應(yīng). 引物容易自身進(jìn)行反應(yīng)形成二聚體.這樣就有來了個 booster PCR 我一直找不到合適的詞來翻譯這個booster.
具體是這樣的.開始幾個cycles保持primer的低濃度,保證primer:template的molar ratio在10 7~ 10 8. 以確保開始擴增的準(zhǔn)確性.然后booste Primer的濃度到正常的水平
8. 循環(huán)數(shù)和長度
確定循環(huán)數(shù)的基本原理是: 產(chǎn)物能夠保證你進(jìn)一步分析操作的zui小循環(huán)數(shù).因為過多的循環(huán)數(shù)容易造 成ERRORS和非特異性產(chǎn)物的積累 產(chǎn)物的量不夠, 優(yōu)化的方法有:
1. 增加TEMPLATE
2. 增加循環(huán)數(shù)
如何確定循環(huán)數(shù),有一個方法.
做一個PCR體系,40循環(huán),50ul, 分別在20,25,30,35循環(huán)時從體系中取5ul,一起跑電泳分析.從而確定*的循環(huán)數(shù)
另一個會影響PCR特異性的是PCR cycling時在兩個溫度間變化的速率（ramping rate）.當(dāng)然是越高 越好.不過咱們大部分條件有限,就那么幾臺PCR儀,也沒有多少挑選的余地
9. thermal cycler
PCR儀的因素我們經(jīng)常容易忽視.長時間的使用后需要調(diào)整PCR儀,以保證其能夠到達(dá)正確的溫度.現(xiàn)在的PCR儀基本上都有自檢功能（self-diagnosis）.
10. PCR additives
附加物或者說enhancer實在是多種多樣. 基本上包括幾類, 能夠增加反應(yīng)退火效率的化學(xué)因子, DNA結(jié)合蛋白和一些商業(yè)試劑. 基本的原理不外是增加引物退火特異性,減少錯配, 增加產(chǎn)物的長度和產(chǎn)量.
在GC Rich情況中, additive可以造成配對堿基間的的不穩(wěn)定,從而提高擴增的效率.而在另一種情況下,additive由于造成錯配的primer-template復(fù)合物的極大的不穩(wěn)定, 而提高了擴增的忠實性.要注意的是,沒有的enhancer全部通用,需要你根據(jù)自己的情況,結(jié)合gradient pcr選擇*條件.
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dimethyl sulfoxide（DMSO） up to 10%
formamide at 5%
trimethylammonium chloride 10-100uM
detergents such as Tween 20 0.1-2.5%
polyethylene glycol （PEG）6000 5-15%
glycerol 10-15%
single stranded DNA binding proteins
Gene 32 protein 1nM
E.coli single-stranded DNA binding protein 5uM
7 deaza-dGTP（for GC rich） 150uM with 50uM dGTP
Taq Extender （stratagene）
Perfect Match PCR Enhancer（stratagene）
Q-solution（Qiagen）
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要注意的是,DMSO,GLYCEROL等會抑制polymerase的活性,所以需要scouting出zui適的濃度
11. Template DNA preparation
提取DNA時的試劑會抑制PCR反應(yīng)的順利進(jìn)行.因此需要對TEMPLATE DNA進(jìn)行純化.特別是SDS（<0.01%） 的情況下就能強烈抑制PCR的進(jìn)行. 可以加入一些nonionic試劑,如Tween, Nonid, Trition之類的反過來抑制SDS. 還有proteinase K也要除干凈, 不然會降解polymerase. 12. Nested PCR
簡單點說 設(shè)計兩對引物, 一對是長的, 一對是包含在長引物內(nèi)的, 用長引物擴增的產(chǎn)物作為第二次擴增的模板,這樣可以增加產(chǎn)物的量. 而且可以減少非特異性帶和錯配的情況.
增加PCR的保真性
高保真酶
高溫DNA POLYMERASE是以單鏈DNA或RNA為模板，在dNTP和一些陽離子的存在情況下，在特定的引物指導(dǎo)下按3'-5'方向合成DNA.包括3種類型
a.5'-3'方向的DNA合成能力,沒有3'-5'方向的外切酶特性.如Taq及其突變體.這類酶的合成能力強,因為他不糾正合成中出現(xiàn)的突變
b.與a類似,有合成活性,沒有3-5的外切活性.但他們能以RNA為模板,合成DNA. 如Tth DNA Polymerase
c.有DNA聚合活性,沒有逆轉(zhuǎn)錄活性,但有3-5方向的外切酶活性.如pfu DNA Polymerase.可以提高忠實性。但是這些聚合酶的產(chǎn)量比Taq DNA聚合酶低。
酶的混合物
將Taq DNA聚合酶同帶有3'到5'外切核酸酶活性第二種聚合酶混合在一起可以獲得比單獨Taq DNA聚合酶高的忠實性，并可以得到高產(chǎn)量及擴增長模板。
其他因素
除了酶，高濃度的dNTP或鎂離子會降低忠實性。將dNTP的濃度從200μM降低到25-50μM可以增加度如果四種核苷的濃度不同，忠實性會受影響。進(jìn)行較少的PCR循環(huán)也會有助于增加忠實性，因為增加循環(huán)數(shù)目和產(chǎn)物長度就會增加突變可能性。
1．簡介
寡聚核苷酸引物的選擇，通常是整個擴增反應(yīng)成功的關(guān)鍵。所選的引物序列將決定PCR產(chǎn)物的大小、位置、以及擴增區(qū)域的Tm值這個和擴增物產(chǎn)量有關(guān)的重要物理參數(shù)。好的引物設(shè)計可以避免背景和非特異產(chǎn)物的產(chǎn)生，甚至在RNA-PCR中也能識別cDNA或基因組模板。引物設(shè)計也極大的影響擴增產(chǎn)量：若使用設(shè)計粗糙的引物，產(chǎn)物將很少甚至沒有；而使用正確設(shè)計的引物得到的產(chǎn)物量可接近于反應(yīng)指數(shù)期的產(chǎn)量理論值。當(dāng)然，即使有了好的引物，依然需要進(jìn)行反應(yīng)條件的優(yōu)化，比如調(diào)整Mg2+濃度，使用特殊的共溶劑如二甲基亞砜、甲酰胺和甘油。
計算機輔助引物設(shè)計比人工設(shè)計或隨機選取更有效。一些影響PCR反應(yīng)中引物作用的因素諸如溶解溫度、引物間可能的同源性等，易于在計算機軟件中被編碼和限定。計算機的高速度可完成對引物位置、長度以及適應(yīng)用戶特殊條件的其他有關(guān)引物的變換可能性的大量計算。通過對成千種組合的檢測，調(diào)整各項參數(shù)，可提出適合用戶特殊實驗的引物。因此通過計算機軟件選擇的引物的總體“質(zhì)量”（由用戶在程序參數(shù)中設(shè)定）保證優(yōu)于通過人工導(dǎo)出的引物。
需要指出的是，引物不必與模板*同源，因此可包含啟動子序列、限制酶識別位點或5’端的各種修飾，這種對引物的修飾不會妨礙PCR反應(yīng)，而會在以后使用擴增子時發(fā)揮作用。
2．基本PCR引物設(shè)計參數(shù)
引物設(shè)計的目的是在兩個目標(biāo)間取得平衡：擴增特異性和擴增效率。特異性是指發(fā)生錯誤引發(fā)的頻率。特異性不好或劣等的引物會產(chǎn)生額外無關(guān)和不想要的PCR擴增子，在EB染色的瓊脂糖凝膠上可見到；引物效率是指在每一PCR循環(huán)中一對引物擴增的產(chǎn)物與理論上成倍增長量的接近程度。
①引物長度；
特異性一般通過引物長度和退火溫度控制。如果PCR的退火溫度設(shè)置在近于引物Tm值（引物/模板雙鏈體的解鏈溫度）幾度的范圍內(nèi)，18到24個堿基的寡核苷酸鏈?zhǔn)怯泻芎玫男蛄刑禺愋缘?。引物越長，擴增退火時被引發(fā)的模板越少。為優(yōu)化PCR反應(yīng)，使用確保溶解溫度不低于54℃的zui短的引物，可獲得的效率和特異性。
總的來說，在特異性允許的范圍內(nèi)尋求安全性。每增加一個核苷酸，引物特異性提高4倍；這樣，大多數(shù)應(yīng)用的zui短引物長度為18個核苷酸。引物設(shè)計時使合成的寡核苷酸鏈（18～24聚物）適用于多種實驗條件仍不失為明智之舉。
②引物的二級結(jié)構(gòu)
包括引物自身二聚體、發(fā)卡結(jié)構(gòu)、引物間二聚體等。這些因素會影響引物和模板的結(jié)合從而影響引物效率。對于引物的3’末端形成的二聚體，應(yīng)控制其ΔG大于-5.0kcal/mol或少于三個連續(xù)的堿基互補，因為此種情形的引物二聚體有進(jìn)一步形成更穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的可能性，引物中間或5’端的要求可適當(dāng)放寬。引物自身形成的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，也以3’端或近3’端對引物-模板結(jié)合影響更大；影響發(fā)卡結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性的因素除了堿基互補配對的鍵能之外，與莖環(huán)結(jié)構(gòu)形式亦有很大的關(guān)系。應(yīng)盡量避免3’末端有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的引物。
③引物GC含量和Tm值
PCR引物應(yīng)該保持合理的GC含量。含有50％的G+C的20個堿基的寡核苷酸鏈的Tm值大概在56～62℃范圍內(nèi)，這可為有效退火提供足夠熱度。一對引物的GC含量和Tm值應(yīng)該協(xié)調(diào)。協(xié)調(diào)性差的引物對的效率和特異性都較差，因為降低了Tm值導(dǎo)致特異性的喪失。這種情況下引物Tm值越高，其錯誤引發(fā)的機率也越大。若采用太高的退火溫度，Tm值低的引物對可能*不發(fā)揮作用。在從一批在特定序列范圍內(nèi)已合成好的寡核苷酸中選擇一對新的引物時，這種GC含量和Tm值的協(xié)調(diào)非常關(guān)鍵。一般來說，一對引物的Tm值相差盡量不超過2～3攝氏度，同時引物和產(chǎn)物的Tm值也不要相差太大，20攝氏度范圍內(nèi)較好。
④引物的額外序列與退火溫度
若有額外的序列信息要加到引物中，例如T7RNA聚合酶結(jié)合位點、限制酶切位點或者GC發(fā)夾結(jié)構(gòu)可以使用加長的引物。一般說來，引物5’端添加無關(guān)序列不會影響引物特異序列的退火。有時候，引物中添加了大量與模板不配對的堿基，可以在較低退火溫度的條件下進(jìn)行4到5個擴增循環(huán)；然后在假定引物5’端序列已經(jīng)加入到模板中，計算得出的退火溫度下進(jìn)行其余的循環(huán)。
在引物上添加限制酶位點時一個重要的考慮是大多數(shù)限制酶的有效切割要求在它們的識別序列的5’端有2至3個非特異的額外堿基，這樣就會增加引物的非模板特異序列的長度。長引物序列的另一個缺點是影響溶解溫度的計算，而這對于確定PCR反應(yīng)時的退火溫度又是必須的。對于低于20個堿基的引物，Tm值可以根據(jù)Tm=4（G+C）+2（A+T）計算。而對于較長的引物，Tm值需要考慮動力學(xué)參數(shù)、從“zui近鄰位”的計算方式得到，現(xiàn)有的PCR引物設(shè)計軟件大多數(shù)都采用這種方式。
⑤引物的3’末端核苷酸組成
引物3’末端和模板的堿基*配對對于獲得好的結(jié)果是非常重要的，而引物3’末端zui后5到6個核苷酸的錯配應(yīng)盡可能的少。如果3’末端的錯配過多，通過降低反應(yīng)的退火溫度來補償這種錯配不會有什么效果，反應(yīng)幾乎注定要失敗。
引物3’末端的另一個問題是防止一對引物內(nèi)的同源性。應(yīng)特別注意引物不能互補，尤其是在3’末端。引物間的互補將導(dǎo)致不想要的引物雙鏈體的出現(xiàn)，這樣獲得的PCR產(chǎn)物其實是引物自身的擴增。這將會在引物雙鏈體產(chǎn)物和天然模板之間產(chǎn)生競爭PCR狀態(tài)，從而影響擴增成功。
引物3’末端的穩(wěn)定性由引物3’末端的堿基組成決定，一般考慮末端5個堿基的ΔG。此值的大小對擴增有較大的影響，負(fù)值大，則3’末端穩(wěn)定性高，擴增效率更高，同時也更易于異位引發(fā)。
需要注意的是，引物3’末端應(yīng)盡量避免T。實驗證明，以T結(jié)尾的引物即使與T, G或C錯配仍可有效延伸。
⑥PCR產(chǎn)物的長度及在耙序列內(nèi)的位置
所有的計算機程序都提供對PCR產(chǎn)物長度范圍的選擇。一般說來，PCR產(chǎn)物長度對擴增效率有影響。特定的應(yīng)用情況下，PCR產(chǎn)物長度部分取決于模板材料。
預(yù)期產(chǎn)物的特定長度經(jīng)常取決于應(yīng)用的需要。若目的是建立測定特異DNA片段的臨床檢驗方法，120～300bp的小DNA擴增產(chǎn)物可能是的。產(chǎn)物應(yīng)具有好的特異性和高的產(chǎn)生效率，并含有能用于探針捕捉雜交實驗的足夠信息。這一長度范圍的產(chǎn)物可以通過采用兩步擴增循環(huán)方法得到，從而減少擴增時間。
其他PCR方法有不同的*產(chǎn)物長度。例如，通過定量的RNA-PCR檢測基因表達(dá)時，產(chǎn)物應(yīng)該足夠大以便構(gòu)成競爭性模板，這樣，產(chǎn)物和競爭物都能夠在凝膠上很容易的分辨出來。這些產(chǎn)物一般在250～750bp范圍內(nèi)。
⑦補充說明
若在cDNA序列內(nèi)找尋PCR引物，需特別注意兩點：首先，盡力將引物和產(chǎn)物保持在mRNA的編碼區(qū)域內(nèi)，因為這是生成蛋白質(zhì)的*序列，不像3’末端非編碼區(qū)域與許多其他mRNA有同源性；第二，盡力把引物放在不同的外顯子上，以便使RNA特異的PCR產(chǎn)物與從污染DNA中產(chǎn)生的產(chǎn)物在大小上相區(qū)別。
若PCR的目的是克隆一個基因或cDNA的特異序列，產(chǎn)物的大小是根據(jù)具體應(yīng)用預(yù)選的。在這里，計算機程序可以提供關(guān)于期望區(qū)域側(cè)翼選擇引物對的信息。
在選擇用來擴增來自不同物種DNA的引物時，應(yīng)避開mRNA的5’和3’末端非翻譯區(qū)序列，因為它們可能沒有任何的同源性。
3．簡并引物設(shè)計
①設(shè)計簡并引物時，一定要檢查靶擴增區(qū)域選定氨基酸遺傳密碼的簡并度。很顯然，我們期望選擇簡并度zui低的氨基酸，達(dá)到提高特異性的目的。
②充分注意物種對于密碼子的偏好性，選擇該物種使用頻率高的密碼子，以降低引物的簡并性。
③應(yīng)努力避免3’末端的簡并，對于大多數(shù)氨基酸殘基來說，意味著引物3’末端不要位于密碼子的第三位。④在一些多義位置使用脫氧次黃嘌呤（dI）代替簡并堿基。
4． 測序引物設(shè)計
當(dāng)然，測序引物的設(shè)計一般都由測序公司來完成，如果需要自己設(shè)計的話；那么除了按照上面所提到的引物設(shè)計通用標(biāo)準(zhǔn)外，還需要注意兩點：
①測序引物的特異性的標(biāo)準(zhǔn)掌握應(yīng)該更嚴(yán)格一些，也就是說設(shè)計時更優(yōu)先考慮特異性。因為在測序反應(yīng)中，如果引物與模板在非預(yù)期位置退火并引發(fā)鏈延伸，會對結(jié)果對來很大的干擾甚至造成結(jié)果無法識讀。
②測序引物的Tm值適當(dāng)高一些?，F(xiàn)在大部分測序反應(yīng)均選用耐熱的測序級DNA聚合酶來催化，并采用PCR的熱循環(huán)程序。選用的測序引物的Tm值稍高一些，有助于使反應(yīng)順利跨過待測模板的二級結(jié)構(gòu)區(qū)，也有助于降低非特異反應(yīng)。
5． 探針的設(shè)計
探針的設(shè)計，根據(jù)不同的用途各有其設(shè)計特點，這里只是就通用的原則進(jìn)行討論：
①探針的長短一般在20-50核苷酸之間，過長合成成本高，且易出現(xiàn)聚合酶合成錯誤，雜交時間長。太短則特異性下降。
②注意G和C的含量努力控制在40-60％，同時一種堿基連續(xù)重復(fù)不超過4個，以免非特異性雜交產(chǎn)生。
③探針自身序列不能形成二聚體，也不能有“發(fā)夾”結(jié)構(gòu)存在，這一點上的要求就要比普通引物設(shè)計嚴(yán)格得多。
④如果探針地靶目標(biāo)是多個基因的混合物，就必須控制該探針與無關(guān)基因之間的相似性在70%以下。
PCR中常見問題分析與對策．
PCR產(chǎn)物的電泳檢測時間
一般認(rèn)為PCR產(chǎn)物應(yīng)在48h以內(nèi)完成電泳檢測，有些于當(dāng)日電泳檢測，大于48h后帶型就會出現(xiàn)不規(guī)則，甚至消失。
Trouble shooting guide
1．假陰性，不出現(xiàn)擴增條帶
PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有①模板核酸的制備，②引物的質(zhì)量與特異性，③酶的質(zhì)量， ④PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究。
模板：①模板中含有雜蛋白質(zhì)，②模板中含有Taq酶抑制劑，③模板中蛋白質(zhì)沒有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白，④在提取制備模板時丟失過多，或吸入酚。⑤模板核酸變性不*。在酶和引物質(zhì)量好時，不出現(xiàn)擴增帶，極有可能是標(biāo)本的消化處理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應(yīng)固定不宜隨意更改。
酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因為酶的活性喪失或不夠而導(dǎo)致假陰性。需注意的是有時PCR時忘了加Taq酶或電泳時忘了加溴化乙錠。
引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴增條帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質(zhì)量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴增，對策為：①選定一個好的引物合成單位。②引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度。③引物使用過程中應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。④引物設(shè)計不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。
Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對PCR擴增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴增的特異性，濃度過低則影響PCR擴增產(chǎn)量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。
反應(yīng)體積的改變：通常進(jìn)行PCR擴增采用的體積為20μl、30μl、50μl或100μl，應(yīng)用多大體積進(jìn)行PCR擴增，是根據(jù)科研和臨床檢測不同目的而設(shè)定，在做小體積如20μl后，再做大體積時，一定要重新摸索條件，否則容易失敗。
物理原因：溫度對PCR擴增來說相當(dāng)重要。如果變性溫度低，變性時間短，極有可能出現(xiàn)假陰性；退火溫度過低，可導(dǎo)致非特異性擴增而降低特異性擴增效率；退火溫度過高，影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴增效率。有時還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計，檢測一下PCR儀或水浴鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。
靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補序列，其PCR擴增是不會成功的。
2．假陽性
引物設(shè)計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進(jìn)行PCR擴增時，擴增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽性。需重新設(shè)計引物。
靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決：①操作時應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣器內(nèi)或濺出離心管外。②除了酶及其他不耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及進(jìn)樣槍頭均應(yīng)一次性使用。③必要時，在加標(biāo)本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性?？苫ハ嗥唇?，與引物互補后，可擴增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生，可用巢式PCR方法來減輕或消除。
3．出現(xiàn)非特異性擴增帶
PCR擴增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計的大小不一致，或大或小，或者同時出現(xiàn)特異性擴增帶 與非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不*互補、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關(guān)。其次，是酶的質(zhì)和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn)，酶的量過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴增。其對策有：①必要時，重新設(shè)計引物。②減低酶的量或調(diào)換另一來源的酶。③降低引物量，適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。④適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點法（93℃變性，65℃左右退火與延伸，也叫兩步法）。
4．出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶
PCR擴增有時出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶的量過大或酶的質(zhì)量差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。其對策有：①減少酶的量，或調(diào)換另一來源的酶。②減少dNTP的濃度。③適當(dāng)降低Mg2+濃 度。④增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)
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